全国抗战爆发后，国共两党实现第二次合作。国民党试图通过合作溶化共产党，吞并人民军队。因此，共产党和人民军队保持独立自主原则是生死攸关的重大问题。
坚持独立自主原则挫败国民党“收编”阴谋
西安事变和平解决后，国民党采取“北和南剿”政策。对在南方八省的红军游击队采取不承认和剿灭政策；在卢沟桥事变后，又被迫对红军游击队改“剿”为“抚”的政策，同时散布共产党向国民党“自新”“投诚”的谣言，并以赏金、名利、免死、不咎既往为饵，试图瓦解红军游击队。
闽西红军游击队代表1937年7月与国民党福建第六行政专员公署张策安谈判时，国民党方面提出：“取消共产党、红军、苏维埃等组织，并停止一切活动”；“即日发表投降自新宣言”；“全部投诚，有枪者点编，徒手遣散”等，并宣称“红军收编后，张鼎丞可以到省政府做厅长，邓子恢可以出洋，其他人由政府发给路费出门或开荒生产”。
皖浙赣边国民党利用共产党的叛徒、原中共下浙皖特委书记何英在1937年8月31日《徽州日报》上刊登《何英招抚旧部同志》的信，并带着国民党的委任状到游击区进行诱降，要红军游击队“向政府投降”。
1937年7月16日，闽粤边红军游击队领导人何鸣对国民党军第157师借谈判之名消灭红军游击队的阴谋缺乏警惕，听命于国民党军当局将800余名红军游击队拉进漳浦县城。结果被第157师解除武装。此即令人震惊的“漳浦事件”。
闽中红军游击队与国民党莆田县当局谈判达成改编协议，就编于国民党军第80师特务大队，接受委任，并听命调赴国民党控制的泉州城，丧失了独立性，为以后游击队领导人被害、169名红军游击队被缴械的“泉州事件”埋下祸根。
鉴于“漳浦事件”的深刻教训，1937年8月1日，中共中央发出《关于南方各游击区域工作的指示》，其中就“武装问题”明确指出：“在保存与巩固革命武装、保障共产党的绝对领导的原则下，可与国民党军政当局谈判，改变番号与编制以取得合法地位，但必须严防对方瓦解与消灭我们的阴谋诡计与包围袭击。”在党中央的指示下，各游击区纷纷与国民党军政当局谈判，并在谈判中坚持独立自主原则。
1937年党中央指示下达之前，浙南红军游击队在与国民党四省边署代表谈判时，对方提出“红军接受收编，统一归国民政府领导和调遣，红军政工干部要全部集中南京受训，另行分配工作”，红军游击队表示不能接受，国民党方面以“停抚进剿”相威胁，谈判破裂。八一三事变后，进剿红军的浙南国民党军调往淞沪前线，边署代表与红军游击队重开谈判，红军游击队坚持中央制定的原则，于9月9日双方达成共识:合作不是投降，改编不是收编，双方是平等合作，要保持红军的独立性。
红28军开始向国民党当局发出停战谈判倡议时，国民党方面企图以官禄瓦解红军游击队，散布什么“若归顺国军，官晋一级，给优厚薪俸”。红军没有上当。经过谈判，签订合作协议，红28军接受鄂豫皖工农抗日联军的番号，高敬亭接受国民党当局的工农抗日联军挺进司令的委任，但表示最后由两党中央决定。得知这一情况后，毛泽东于9月15日电报要高敬亭在谈判中“一切大问题听候两党中央谈判解决”，“不许国民党插入一个人”。10月15日毛泽东要林伯渠写信给高敬亭，“重复说明坚持独立性，拒绝外人”，于是高敬亭退回了国民党的委任状，取消了“抗日联军”的番号，挫败了国民党吞并红28军的阴谋。
湘鄂赣边红军游击队代表在与国民党武汉行营代表谈判中，于1937年8月底达成停战和红军改编协议，湘鄂赣边红军游击队改番号为湘鄂赣抗日军第1游击支队，但接受武汉行营派副司令、参谋长、副官主任、军需主任、副官等6人到支队任职。得知这一情况后，张闻天、毛泽东于9月14日发出指示，指出“湘鄂赣边区傅秋涛等派至武汉谈判代表，承认武汉行营派军需主任、副官主任等许多人到部队中去及其它许多不利条件，完全错误。已电伯渠、必武，通知谈判代表停止谈判，即速回去，由傅秋涛另派代表，否定原定条件，重定办法”，坚持“国民党不得插进一个人来”。当湘鄂赣红军游击队改编为新四军第一支队第一团时，根据党中央的指示，将国民党派来的“副司令”、“参谋长”等礼送出境，维护了共产党对这支武装的绝对领导。
当得知项英在江西南昌发出《告南方游击队的公开信》中，有“把全部游击队改编为抗日救国的武装，统一于国民政府之下”等内容后，中共中央于10月1日致电张云逸等，指出“项英同志似还不明白统一战线中保持独立性原则”。10月1日，博古在给项英、陈毅的信中特别强调：“不允许国民党派人到队伍中来，队伍可以变番号为保安独立大队，或其他名义，只受当地最高机关之节制，这为保持军队之独立性及我们的绝对领导。”
1937年11月21日，当叶挺向蒋介石谈到延安关于新四军干部的安排，蒋介石表示“延安提出干部名单不能同意”。而毛泽东则坚持新四军的干部由共产党独立安排，国民党方面不得干涉新四军内部人事安排。最终蒋介石派国民党军官任职新四军的企图未能得逞。
坚持独立自主原则突破国民党“画地为牢”的限制
新四军编成后，江南的第1、第2、第3支队受国民党三战区统辖，江北的第4支队受第五战区统辖。
毛泽东在1938年的“五四指示”中提出的对策是：“现时方针不在与他们争若干的时间与若干里的防地，而在服从他的命令，开到他指定的地方去，到达那里以后，就有自己的自由了。”新四军在敌后开展游击战争牵制消耗日军，以配合国民党军正面战场作战，但在政治上、组织上、行动上保持自己的独立性。
1939年春，周恩来到皖南军部时，提出新四军发展方向的三原则：“一、哪个地方空虚，我们就向哪个地方发展。二、哪个地方危险，我们就到哪个地方去创造新的活动地区。三、哪个地方只有敌人伪军，友党友军较不注意没有去活动，我们就向哪里发展。”这个原则就是独立自主的发展原则。周恩来与新四军主要领导人共同商定新四军的发展方针：“向北发展，向东作战，巩固现在阵地。”要执行这个发展方针，就必须突破国民党原来划定的新四军防地范围。怎样突破？既要敢于突破，又要善于突破。
新四军第1支队司令员陈毅在“向北发展，向东作战”方针鼓舞下，1939年4月，派挺进纵队司令员管文蔚部拿下长江中间的扬中岛，架起新四军向北发展的“跳板”。这是突破国民党限制，独立自主发展的尝试。
1939年5月，陈毅拟派叶飞的老6团向苏南东路地区挺进。项英担心新四军去东路会担破坏统一战线之责。陈毅要6团以江南抗日义勇军第二路的番号出现，要叶飞化名叶琛，指战员不戴新四军臂章。又在茅山地区组建了以段焕竞为团长的新6团。陈毅并请军部转报顾祝同：“叶飞因病告长假，其职由段焕竞代理。”造成6团仍在茅山的假象。“江抗”东进后，一直打到上海近郊虹桥机场，取得人、枪、款的大发展。这也是新四军坚持独立自主发展的成果。
1939年11月，陈毅派张道庸、卢胜率第4团团部与第2营，以协助李明扬从苏南运送子弹去苏北的名义渡江北上，完成任务后，张道庸改名陶勇，部队以苏皖支队的番号，在扬州以西仪征、六合、天长地区活动。这是新四军突破国民党的限制，向北发展的开始。
坚持独立自主原则建立抗日民主政权
国民党顽固派于1939年冬掀起的第一次反共高潮，在华北遭八路军有力反击失败后，便于1940年春将反共摩擦重心移向华中。为隔断新四军与八路军的联系，1940年3月25日，国民党第三战区司令长官顾祝同转发蒋介石电令：要新四军“江北部队全数移至江南”，“不得故意延宕，否则以违抗命令破坏抗战论罪”。3月29日，毛泽东、王稼祥致电八路军、新四军：“华中之皖东、淮北、苏北成为顽方必争之地，目的在隔断我八路军、新四军之联络，陷新四军于危境。”4月，项英派袁国平去上饶与国民党第三战区谈判新四军的活动区域时，项英以新四军与国民党第三战区是上下级关系，第三战区以命令形式下达，不好拒绝为由，屈从国民党方面的压力，一再要求中共中央同意将江北新四军南调。这跟党中央发展华中的战略意图是相悖的。党中央4月20日电报中指出“在与顾谈判中，绝对不能答允四、五支队和叶、张两团之南调，现在和将来，全部或一部均不能南调……目前对顾可用各种方法借口以延搁之。”然而，项英于4月22日仍致电党中央，“再度坚决要求叶、张两团南调”。在此情况下，党中央不得不停止新四军与三战区顾祝同的谈判，改由周恩来与重庆当局谈判，坚持了新四军的独立性。
针对新四军个别领导人对坚持新四军独立自主原则不够的问题，毛泽东在1940年的“五四指示”中，指示新四军：“不受国民党的限制，超越国民党所能允许的范围，不要别人委任，不靠上级发饷，独立自主地放手扩大军队，坚决地建立根据地，在这种根据地上独立自主地发动群众，建立共产党领导的抗日统一战线的政权，向一切敌人占领区域发展。例如在江苏境内，应不顾顾祝同、冷欣、韩德勤等反共分子的批评、限制和压迫，西起南京，东至海边，南至杭州，北至徐州，尽可能迅速地并有步骤有计划地将一切可能控制的区域控制在我们手中，独立自主地扩大军队、建立政权，设立财政机关，征收抗日捐税，设立经济机关，发展农工商业，开办各种学校，大批培养干部。”“五四指示”还指出：“对于反共顽固派的一切反动的法律、法令、宣传、批评，我们应提出针锋相对的办法和他们作坚决的斗争。例如，他们要四、五支队南下，我们则以无论如何不能南下的态度对付之；他们要叶、张两部南下，我们则以请准征调一部北上对付之；他们说我们破坏兵役，我们就请他们扩大新四军的募兵区域；他们说我们的宣传错误，我们就请他们取消一切反共宣传，取消一切摩擦法令。”
国民党是不允许新四军在敌后建立抗日民主政权的，新四军个别领导人也认为新四军建立政权，要经过国民党政府批准，或呈报第三战区司令长官顾祝同加委或选派。对此，1940年3月6日，中共中央《关于抗日根据地的政权问题》一文指出：“目前是国民党反共顽固派极力反对我们在华北、华中等地建立抗日民主政权，而我们则必须建立这种政权，并已经可能在各主要的抗日根据地内建立这种政权的时候。”毛泽东在“五四指示”中也说“不要别人委任”，“独立自主地发动群众，建立共产党领导的抗日统一战线的政权”。新四军贯彻党的独立自主原则，开辟了八块敌后抗日根据地，建立了数十个县级抗日民主政权。
皖南事变后，为了反击国民党顽固派撤销新四军番号的反动通令，坚持抗日斗争，中共中央针锋相对的第一个步骤是，中共中央军委于1月20日发布命令，重建新四军军部。新四军新军部成立后，摆脱了国民党的控制，进入完全独立自主阶段。新四军在反“扫荡”、反“清乡”、反摩擦斗争中，日益发展壮大，取得抗战最后胜利。